MassWorks软件赋能Orbitrap：开创唯一分子式鉴定的新时代
——Cerno Bioscience公司总裁王永东博士专访
在质谱分析领域，Orbitrap质谱以超高分辨率和卓越的质量精度，成为鉴定化合物的利器。当以1-5 ppm的质量准确度测定小分子化合物时，理想上可以得到唯一的分子式，但实际情况并非如此。Orbitrap给出的答案往往是几个甚至更多的候选的分子式，而且这些候选物的搜索匹配得分非常接近。能否让Orbitrap在鉴定时“一锤定音”，给出唯一的分子式？今年ASMS上，k8凯发天生赢家一触即发人生采访了Cerno Bioscience公司的总裁王永东博士，他给出了肯定的答案，并在ASMS上分享了数据结果。接下来，就让我们一同体会一下这项新技术吧，相信它定会开创Orbitrap唯一分子式鉴定的新时代。
Cerno Bioscience公司总裁王永东博士（右）k8凯发天生赢家一触即发人生总经理卞利萍（左）
技术背景与原理
王永东博士先为我们介绍了该技术的背景。Orbitrap高分辨质谱仪以其卓越的质量准确度著称，能够准确测量化合物的质量。然而，仅凭最高丰度离子的质量准确度往往难以唯一确定化合物的元素组成，比如，Orbitrap给出的答案往往是几个甚至更多的候选的分子式，而且这些候选物的搜索匹配得分非常接近，这主要是因为Orbitrap使用高分辨采集质谱图时，质量准确度高但谱图准确度不高。
Cerno公司此前开发的MassWorks，主要特色就是提出“谱图准确度（SA）”的概念和算法，在应用谱图准确度校正所采集的谱图后，可以大幅提高质量测定的准确度，比如让低分辨质谱的质量测定准确度大幅提升至毫道尔顿（mDa）水平再结合谱图准确度可以进行元素组成的测定。“这主要是因为，低分辨质谱往往拥有较高的谱图准确度。”王永东表示。
“现在Orbitrap的用户越来越多，几乎所有有定性需求的实验室，都会购买或将要购买Orbitrap。”王永东说道，“在小分子鉴定中，Orbitrap用户仅有的难题就是，得不到唯一的分子式；虽然后续对候选化合物可以用MS/MS等方法去再次比对验证，但结果仍然是差强人意。谱图准确度的功能是否能够用在Orbitrap上？我们同康涅狄格大学化学系质谱中心实验室的Adam Graichen博士合作，做了一系列试验，获得了惊人的结果。”
交替采集 双向奔赴 唯一结果
MassWorks软件可利用高分辨质谱与低分辨质谱的互补性，通过先进的算法对低分辨谱图的谱图准确度进行计算。在数据分析过程中，MassWorks软件首先利用高分辨质谱的精确质量数缩小搜索范围，然后结合低分辨谱图的特征进行精细筛选，最终确定化合物的唯一分子式。这一过程不仅提高了分析的准确性，还大大缩短了分析时间。
合作团队开展了一项针对小分子化合物的精确鉴定研究。研究选取了Restek 31977 LC 多残留农药标准品 #6（28 种组分）进行液质联用分析，这些化合物的分子量均在500 Da以下，涵盖了多种常见的有机元素。
实验采用Orbitrap LC/MS系统，通过交替采集高分辨谱图和低分辨谱图的方式进行数据采集。在每个确定的RT窗口内，，交替进行高分辨度（120,000）和低分辨度（15,000）的全扫描质谱采集, 每个分辨度下可取得3次全MS扫描。
利用Thermo Xcalibur软件进行数据预处理，提取出每个化合物的准确质量数和保留时间。然后，将数据导入MassWorks软件sCLIPS版，进行元素组成搜索和谱图准确度计算。经过数据处理和分析，MassWorks软件成功鉴定出所有能检测到的26种小分子化合物的唯一正确分子式。
结合高、低分辨扫描数据，给出26种化合物的唯一“命中”结果，排名均为第1位
实际测量结果显示，120,000高分辨模式下，所有化合物的质量误差均小于0.6 mDa，平均标准偏差小于0.2 mDa，可以直接根据1 mDa的质量误差范围来搜索鉴定化合物，但因谱图准确度有限而只有中等的命中率。15,000的低分辨模式下，虽然质量误差和标准偏差都显著增加，但可利用MassWorks软件的谱图准确度来准确筛选分子式。
将搜索范围限定在500 Da范围内，用高分辨采集获得的精准质量数进行元素组成搜索，考虑了所有可能的有机元素，包括碳、氢、氧、氮、硫以及部分不常见元素如硅、氟、磷和钠等。然后用MassWorks根据低分辨谱图的谱图准确度来排序，成功地将所有26种正确化合物排在搜索结果的首位，且首选分子式与次选分子式之间的谱图准确度差异显著增大（中位数从0.4%增至1.6%），从而实现了唯一分子式的精确鉴定。
比如，对于Penconazole（化合物#22），在高分辨模式下检索结果为第1位；在低分辨模式下，MassWorks软件通过谱图准确度计算，再结合高分辨的准确质量数结果，也成功将Penconazole排在搜索结果的第1位，但谱图准确度高达98.5%。
Penconazole（化合物#22）检索结果为第1位
对于Flusilazole（化合物#14），在高分辨模式下，Flusilazole的检索结果为第17位；在低分辨模式下，MassWorks软件通过进一步的谱图特征分析，成功识别出Flusilazole的正确分子式，并将其提升至搜索结果的首位，谱图准确度也达到了98.9%。
仅用高分辨数据检索，Flusilazole（化合物#14）排名第17位，加入低分辨谱图的谱图准确度检索，Flusilazole排名第1位
突出优势 道出原理
谈及该技术的优势，王永东表示，首先，提高了分析置信度。通过结合高分辨质谱的精确质量数和低分辨质谱的谱图准确度特征，MassWorks软件显著提高了小分子化合物分析的置信度。这种双重验证的方式使得即使在完全未知样品中也能准确鉴定出目标化合物的分子式。其次，缩短了分析时间。多采集一张低分辨的谱图所需时间只有采集高分辨谱图所需时间的1/8，增加的时间可忽略不计。传统的元素组成搜索方法往往需要耗费大量时间进行多轮质谱分析。而MassWorks软件通过一次进样同时采集高分辨和低分辨谱图的方式，大大缩短了分析时间。这对于需要快速鉴定大量化合物的应用场景具有重要意义。第三，成本可控。高分辨质谱仪本身成本较高，通过增加MassWorks软件，可以在不增加额外硬件成本的情况下显著提升分析性能。
为什么Orbitrap采用高分辨测定时谱图准确度不高？王永东形象地比喻说，Orbitrap获得高分辨主要是让离子在静电阱中“多转几圈”，但所谓“夜长梦多”，在跑动的过程中，由于离子都带同样电荷，会存在Space Charge效应，丰度高的离子倾向于吸收丰度低的离子到一团，大家一起跑，这样有助于降低能量消耗。这种“大吃小”就造成了丰度的变化，破坏了同位素的精细结构，而且跑得圈数越多（分辨率越高），丰度误差就越大；甚至有时还会存在离子的碰撞，导致某些丰度离子的湮灭。
未来展望
谈到对未来的展望王永东表示：这次ASMS发布的结果使用的是MassWorks标准版，Cerno将很快发布自动化的版本，进一步简化用户的操作，提高其处理复杂完全未知样品的能力和分析速度。同时，公司还将探索更多新的算法和模型，以进一步提升分析的准确性和可靠性。公司希望加强与全球科研机构的合作与交流，共同推动质谱技术的发展和应用。“将谱图准确度应用于Orbitrap，让您鉴定分子式可以信心满满，百发百中。”
参考文献：
Combining Accurate Mass from High Resolution and Spectral Accuracy from Lower Resolution towards Unique Elemental Composition Determination. ASMS 2025 poster ThP474. Adam Graichen1 and Yongdong Wang2, 1Department of Chemistry, University of Connecticut, Storrs, CT； 2Cerno Bioscience, Las Vegas, NV
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