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安捷伦科技（中国）有限公司
糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰之一，正确的糖链像精密的分子支架，维持蛋白三维结构、决定细胞定位与分泌路径；细微的糖型差异即可充当信号开关，调控受体结合、免疫逃逸和炎症反应。在肿瘤、感染或遗传病中，糖基化的异常往往成为疾病早期标志物或治疗靶点。然而，糖蛋白组的深度解析，一直是技术上的巨大挑战。
布鲁克提供一站式的糖蛋白质组学的分析工具，覆盖样品制备、色谱分离、质谱数据采集、数据分析的全流程
CSI 纳升离子源配合 NanoBooster，提高糖肽分析的灵敏度；离子淌度功能实现糖链异构体基线分离；
Glyco-PASEF 采集模式和 300Hz 超快速扫描精准锁定目标糖肽；
GlycoScape 软件消除数据分析的瓶颈，提供完整糖肽的位点、糖型和 CCS 值等完整信息（图1）。
图1. 布鲁克完整的糖蛋白质组学分析解决方案
CaptiveSpary NanoBooster
离子源
在 CaptiveSpray 离子源中，向鞘气里精准掺入少量助剂（如乙腈蒸汽），改变液滴表面化学环境，液滴表面张力降低，去溶剂更快，液滴更小；同时，助剂分子作为“质子中继介质”，通过气相质子传递机制，提高糖肽离子化效率，增加糖肽带电荷数，提高糖肽 MSMS 碎片丰富度（图2）。
图2. NanoBooster 提升糖肽分析性能。(A) 不同助剂（ACN、MeOH、EtOH、IPA）的电荷为 2、3、4 糖肽的总强度比较。(B) 糖肽的二级谱图，包括丰富的糖链碎片离子和肽段碎片离子。(C) 三种 N-糖肽（H?N?S?、H?N?S?F、H?N?S?F?）分别加入 MeOH、EtOH、IPA 助剂后的提取离子流色谱图，ACN 助剂提升信号最明显。
tims离子淌度功能
实现寡糖异构体的分离
糖肽经过电喷雾离子化后，首先进入第一级 TIMS 进行离子富集，有效抑制化学背景噪声；随后进入第二级 TIMS，根据碰撞截面积（CCS）差异实现 α1,3/α1,6 键合异构体的高分辨率气相分离；同步运行的 PASEF（>300 Hz）通过动态协调四级杆隔离窗口与 TIMS 淌度扫描时序，最大化低丰度糖肽的占空比。该策略显著提升了糖肽的分离度与鉴定深度（图3）。
图3. TIMS 分辨 α1,3- 与α1,6- 连接的同分异构 C3 和 C6 寡糖，C3 实测碰撞截面积（CCS）为 408.1 ??，C6 实测碰撞截面积（CCS）为 418.4 ??，tims 可基线分离仅差 10.3 ?? 的键合异构体，证明其淌度具有超高分辨能力。
Glyco-PASEF
智能采集方式
Glyco-PASEF 是专门在 timsTOF 仪器上实现的糖肽的数据采集模式，tims 离子淌度能够区分未修饰的肽和 N-糖肽。由于糖链部分的加入，糖肽的尺寸显著大于非修饰肽段，在淌度图（mobilogram）中形成明显簇集。借助糖肽与非修饰肽段的物理分离，不仅扩大了动态范围，还可将该簇集作为高效选择过滤器，引导质谱靶向感兴趣的分析物。
Glyco-PASEF 包括：(1) 在淌度图中框定感兴趣区域，(2) 采用阶梯碰撞能量（stepped collision energies）在 timsTOF 上获得信息丰富的糖肽串联质谱，即“糖多边形-阶梯碰撞能量-并行累积串行碎裂”（glyco-polygon-stepped collision energy-parallel accumulation serial fragmentation）（图4）。
图4. Glyco-PASEF 原理。（A）TIMS 装置可在淌度维度将糖肽与非修饰肽段进行分离。（B）所有离子类别在 m/z 与离子淌度（1/K?）的信号分布，图中以多边形示意糖肽离子簇在 IM 域中的范围。（C）糖肽与非修饰肽段在离子淌度空间中的物理分离密度图。
Stepping 碰撞碎裂
获得高质量糖肽谱图
在 timsTOF 质谱仪上，采用双能量阶梯碰撞模式，低碰撞能优先断裂糖苷键，保留肽段主链完整，生成 Y 型糖碎片用于糖链鉴定；高碰撞能断裂肽键，生成 b/y 离子用于肽段鉴定。通过糖链数据库匹配和肽段序列匹配对两套谱图进行联合解卷积，实现糖链组成和肽段的鉴定（图5）。
图5. Stepping 碎裂对糖链和肽段序列的解析。
GlycoScape 软件
完整糖肽实时鉴定
GlycoScape 软件为专用糖肽检索软件，可以实现糖链和肽段序列的解析。timsTOF在 PASEF 模式下同步记录肽段与糖链的碎片信息，生成高分辨率 MS?谱图，通过 ProLuCID 搜库引擎对肽段主链进行初步鉴定；利用 Oxonium ion 指纹（如 m/z 204.087、366.139 等）快速过滤含糖苷碎片，随后调用 pattern finder 解析糖链核心结构，比对糖链质量（前体质量- 肽段质量）与理论 N-糖链库，确保质量误差 ≤ 5 ppm；分别输出肽段谱图（b/y 离子）与糖链谱图（Y/Z 离子），实现糖基化位点与糖链组成的同步解析。此外，GlycoScape 平台内置 Myriad 算法，无需依赖糖链数据库，直接从 timsTOF 产生的高分辨率二级谱中实时重构完整糖肽结构，可发现未知或罕见糖型的发现（图6）。
图6. GlycoScape 软件鉴定糖肽流程。
应用案例
案例一、人血浆糖蛋白质组
Baerenfaenger 等人在 timsTOF Pro 2 平台上，构建了一套临床血浆样品的完整 N-糖肽分析流程，优化了碰撞能量（CE）， 在默认斜率基础上整体上调 50 %，并随离子淌度（1/K?）线性递增；碰撞池 RF 电压 从 1500 eV 提至 1700 eV，增强高 m/z 糖肽及 Y-ion 传输；TIMS 隔离宽度（PASEF），由默认 2.75 ms 扩至 7.5 ms，覆盖糖肽更宽的淌度，并优先选取糖肽区域；使用 NanoBooster，ACN 氮气为助剂，使糖肽平均电荷态由 2–3+ 升至 3–5+，带来约 4 倍鉴定提升；使用 15 cm 反相柱分离，15 min 梯度即可鉴定约 1,200 条、30 min 鉴定 1,500 条 N-糖肽（图7）。
图7. 糖肽鉴定结果比较。（A）不同梯度对肽段（蓝色）和糖肽（红色）鉴定结果的影响。（B）采用 30 min 梯度，不同方法的鉴定结果比较。
案例二、高通量自动化 HILIC 糖肽富集和 glyco-PASEF 分析流程
布鲁克研发团队在 timsTOF Ultra 2 上搭建了自动化 HILIC-glyco-PASEF 糖蛋白质组学流程，首先在 AssayMAP Bravo 平台完成 96 孔 HILIC-SPE 微柱富集，全程 < 2 小时，技术重复 CV < 10 %；随后使用 nanoElute 2 和 timsTOF Ultra 2，进行 67 min 梯度分离和数据采集，采用 6 PASEF scans / 1.38 s 周期，TIMS 0.80–1.60 1/K? 区间，阶梯 CID（CE1 35–54 eV、CE2 40–100 eV）同步碎裂糖链与肽段；实时 GlycoScape 2025b 与离线 MSFragger 22.0 双重解析。采用该方法分析血浆（EDTA/柠檬酸）和 HeLa、K562 细胞裂解液样品，富集后糖肽鉴定数分别提升 5–9 倍，EDTA 血浆中鉴定 1305 条糖肽，柠檬酸血浆中鉴定1891条糖肽，Hela 中鉴定 4763条糖肽，K562 中鉴定 1628 条糖肽。GlycoScape 与 MSFragger 结果高度一致，验证了流程的准确性与可靠性（图8）。
图8. 血浆样品和细胞样品中糖肽鉴定数量的比较，GlycoScape（A）与MSFragger（B）。
总结
布鲁克 timsTOF 糖蛋白组完整解决方案，凭借其超高灵敏度（NanoBooster）、精准分离能力（TIMS）、智能采集模式（glyco-PASEF）和强大解析软件（GlycoScape），成功突破了糖蛋白组学分析的瓶颈，为疾病标志物发现、药物靶点研究等提供了强大工具。
参考文献：
1. Automated, high-throughput HILIC-enriched glycopeptide profiling of plasma and cell lysates with glyco-PASEF using the timsTOF Ultra 2 mass spectrometer. Bruker Application Note LCMS 239.
2. Oxonium Ion–Guided Optimization of Ion Mobility– Assisted Glycoproteomics on the timsTOF Pro. Mol Cell Proteomics 2023, 22(2), 100486.
3. Maximizing Glycoproteomics Results through an Integrated Parallel Accumulation Serial Fragmentation Workflow. Anal. Chem. 2024, 96, 8956?8964.
4. The GlycoPaSER Prototype as a Real-Time N-Glycopeptide Identification Tool Based on the PaSER Parallel Computing Platform. Int. J. Mol. Sci.2023, 24(9), 7869.
